Метод исследования мокроты на туберкулёз

Палочки размножаются в лёгких, образуют там колонии, выделяются при кашле, именно поэтому исследование мокроты – важный диагностический этап. Лабораторная диагностика делается в основном микроскопическим, микробиологическим методом, бактерии культивируют на плотных средах Левенштейна-Йенсена или Финна-II, окрашивание выполняют по Цилю-Нильсену. Есть и другие технологии, но все они не идеальны, имеют свои преимущества и недостатки.

Общие сведенья о туберкулёзе

Туберкулёз легких называют ещё чахоткой, что является устаревшим названием. Возбудитель – различные представители вида Mycobacterium tuberculosis complex, которых ещё называют палочками Коха (в честь первооткрывателя). Бактерии туберкулёза поражают в основном лёгкие, где образуют многочисленные колонии. Именно поэтому можно исследовать мокроту на наличие возбудителя. Также они формируют туберкулы – полые узелки из соединительной ткани, внутри которых находится гной и масса бактерий.

Ценность лабораторной диагностики мокроты

Лабораторное исследование мокроты довольно редко проводится для обнаружения людей, заражённых туберкулёзом. Чаще применяется для подтверждения диагноза, анализа состояния пациента, подстройки лечения, дозировки при химиотерапии, контроля результатов терапии. То есть оценка мокроты является постоянным необходимым способом исследования.

К лабораторной диагностике относится множество методов:

• макроскопия;
• микроскопия;
• иммуноферментный анализ;
• флуоресцентная микроскопия;
• полимеразная цепная реакция;
• культивирование.

Показанием к исследованию мокроты лабораторными методами являются признаки туберкулёза:

• гипертермия;
• длительный продуктивный кашель;
• затемнения на флюорографии.

К достоинствам технологии относят следующие факты:

• результат можно получить достаточно быстро при ПЦР и микроскопии;
• установить точный штамм бактерии;
• проконтролировать влияние химиотерапии или антибиотиков.

Минусы анализа мокроты следующие:

• при скрытой форме туберкулёза бактерии не выделяются при кашле, из-за чего результат лабораторной диагностики будет отрицательным;
• мокроту довольно трудно собрать, для этого нужна специальная герметичная ёмкость;
• некоторые методы (культивирование) довольно длительные – более месяца.

Сбор мокроты

Можно брать экссудат следующего рода:

• материал после ингаляции небулайзером;
• промыванием бронхов специальными растворами;
• мокрота из альвеол;
• получение слизи при бронхоскопии;
• взятие биоптата их трахеи, бронхов или плевры;
• мокрота из бронхов;
• мазки с гортани.

Мокроту собирают в плотно закрывающиеся стерильные и герметичные ёмкости. Это нужно для снижения вероятности занесения микробов в окружающий мир.

Ёмкости должны соответствовать следующим требованиям:

• делаться из ударопрочного материала;
• иметь хорошую прозрачность для возможности визуальной оценки качества и количества мокроты;
• расплавляться при температуре 40-45 градусов;
• иметь объём не меньше 40-50 мл;
• отверстие должно быть шире 3 см.

Результативность и достоверность исследования мокроты зависит от правильности её сбора, соблюдения рекомендаций, которые должны минимизировать вероятность загрязнения материала. Кроме того, откашливание производится в герметичной комнате, так как данная процедура опасна для всех окружающих.

Что нужно знать при сборе мокроты?

При сборе материала нужно соблюдать ряд правил:

• откашливание мокроты во флакон делается до начала химиотерапии;
• также его проводят обязательно с утра, до завтрака и приёма препаратов;
• при исследовании берут 3 пробы (каждый раз откашливая в новую ёмкость) в течение 3 суток подряд;
• материал сразу же отвозят в лабораторию (в течение часа). В идеале она должна находиться в одном здании с туберкулёзным стационаром;
• при невозможности это сделать пробу ставят в холодильник при +4оС, но держать там можно не более 2 суток;
• крайне важно следить за целостностью ёмкостей. Нарушение герметичности приводит не только к порче пробы, но и к опасному заражению окружающей среды;
• объём одной пробы должен составлять 3-5 мл;
• медицинский работник обязательно одевает халат, шапку, медицинскую маску, резиновые перчатки и специальный фартук;
• больному нужно откашливать не слюну или слизь из носа и глотки, а именно мокроту из нижних отделов бронхов. Для создания продуктивного кашля можно сделать 2-3 глубоких вдоха;
• перед откашливанием рот тщательно промывают водой, чтобы удалить естественную микрофлору и кусочки пищи;
• ёмкость держат у самых губ, после откашливания мокроту сразу сплёвывают;
• медицинский работник стоит сзади больного, чтобы мокрота не попала на него. Его задача – контролировать правильность сбора материала;
• после сбора слизи флаконы сразу герметично запечатывают;
• если больному трудно откашливать мокроту, то накануне вечером, а также рано утром перед сбором слизи пациенту даёт отхаркивающие препараты.

Режим сбора материала для лабораторного анализа на туберкулёз легких зависит от стадии развития и лечения заболевания:

1. При первом поступлении в течение 3 суток делают по 3 пробы ежедневно.
2. Во время лечения ежемесячно собирают 3 пробы за раз.
3. На долечивании каждые 2-3 месяца берут 2 пробы мокроты.

Методы диагностики

Исследование мокроты делается множеством способов. У каждого метода есть свои преимущества и недостатки, выбор технологии диагностики зависит от решения врача и оснащения больницы.

Макроскопический анализ

Характер мокроты зависит от стадии туберкулёза лёгких:

1. При инфицировании на латентной стадии мокроты может не быть, или она имеется, но в минимальном количестве и обладает белым цветом или прозрачностью.
2. При развитии клинической стадии мокрота приобретает выраженный гнойный характер, оттенок меняется на серый, жёлтый или зелёный, появляется неприятный запах.
3. На более поздних стадиях, при появлении рецидивов в мокроте обнаруживаются прожилки крови.

Микроскопический анализ

Наиболее быстрый, простой и дешёвый способ оценки материала на туберкулёз легких. За счёт этого может применяться для постановки диагноза, однако он не имеет достаточно высокой надёжности, поэтому его сочетают с флюорографией. Используется для оценки состояния больного в процессе лечения.

Применяется 2 метода:

1. Прямая микроскопия. Материал готовится непосредственно из мокроты.
2. Микроскопия осадка. Материал концентрируется с помощью центрифугирования.

Для 50% достоверности метода нужно минимум 5000 бактерий на мл мокроты.

Для увеличения надёжности способа исследуют минимум 3 пробы материала. Получение отрицательного результата не означает отсутствие туберкулёза, так как мокрота может содержать очень малое количество возбудителей из-за закрытой формы.

Окраска делается по Цилю-Нельсену:

1. В материал вносится карболовый фуксин при повышенной температуре и протравливании фенолом, который проникает во все бактерии препарата.
2. Препарат обесцвечивается 25% серной кислотой и 3% солянокислым спиртом. Из-за восково-липидной мембраны палочки Коха не подвергаются воздействию кислот, поэтому они сохраняют окраску.
3. Остальные микробы подкрашиваются 0,3% метиленовой синью. Бактерии туберкулёза не восприимчивы к анилиновым краскам, из-за этого цвет у них не меняется.

В итоге палочки Коха приобретают красный цвет, а все остальные клетки – синий. Препарат надо рассматривать через световой бинокулярный иммерсионный микроскоп с тысячекратным увеличением. Для постановки диагноза обычно хватает 100 полей зрения. При отсутствии бактерий рекомендуется просмотреть ещё 200 полей.

Иммуноферментный анализ

Метод основан на реакции антигена и антитела. Антитела – специфические иммуноглобулины, которые образуются в ответ на проникновение бактерий и вирусов. Антиген – протеины, вызывающие выработку иммуноглобулинов.

Проводится в 2 этапа:

1. Берётся антитело, меченное каким-либо веществом. Оно добавляется в материал, где присутствует антитело. В ходе реакции образуется единый комплекс.
2. Добавляется фермент, который меняет цвет меченных комплексов антиген-антитело. Интенсивность окраски материала указывает на количество иммуноглобулинов.

Автоматизированная система ВАСТЕС MGIT 960

ВАСТЕС MGIT960 – автоматизированный прибор на 960 проб, который самостоятельно проводит исследование материала. Суть метода состоит в следующем:

1. В ёмкость вносится флюоресцирующий материал, флуоресцентные свойства которого блокируются с помощью кислорода.
2. Бактерии при своей жизнедеятельности поглощают кислород, уменьшают его количество.
3. Из-за снижения концентрации усиливаются флуоресцентные свойства материала. Оно регистрируется в автоматическом режиме.

Первые результата регистрируются на 4-5 день, а для достижения максимума нужно 11 суток.

Флуоресцентная микроскопия

Люминесценция позволяет поднять результативность исследования на 10-15%, а требуемое время на это снизить в 2-3 раза. Применяют флуоресцентные краски: аурамин и родамин. Их действие связано со способностью вступать в реакцию с воскоподобными веществами бактериальной мембраны возбудителя. При облучении ультрафиолетом окрашенные таким способом палочки Коха начинают светиться оранжевым или красным цветом, при том, что остальной материал имеет чёрный или тёмно-зелёный оттенок.

Важно! Недостатком является сравнительно высокая стоимость метода.

Из-за того, что бактерии в препарате становятся очень яркими и контрастными, то можно уменьшить расширение микроскопа в 4-10 раз, сократив тем самым необходимое время на исследование материала. К тому же флуоресцентная окраска при соотнесении с окрашиванием по Цилю-Нельсену может дать информацию, сколько бактерий потеряло кислотоустойчивые свойства вследствие химиотерапии.

Полимеразная цепная реакция

Метод основан на увеличении количества ДНК возбудителя в материале в 100-110 раз за счёт специальных ферментов. Данный способ применим лишь для тех микробов, у которых точно установлен состав нуклеотидной последовательности. В отличие от копирования ДНК в результате деления клеток при ПЦР создаются лишь обрывчатые короткие участки ДНК.

Метод имеет множество преимуществ:

• для положительного результата достаточно 10-100 бактерий в пробе;
• абсолютная специфичность, так как метод применяется для конкретной ДНК;
• результат становится известным через 4-5 часов.

Тем не менее, из-за высокой чувствительности метода возможны ложноположительные результаты, что является существенным минусом. Диагностика проводится с помощью амплификатора – специального прибора, в котором проходит реакция. Он создаёт условия для ПЦР и может использоваться для хранения препарата.

Культивирование на средах

Для культивирования рекомендуется плотная среда. На западе используется состав Левенштейна-Йенсена, который даёт колонии через 15-25 суток. В России применяют среду Финна-II, которая уменьшает срок получения результата на 2-3 дня и увеличивает вероятность появления колонии на 6-8%. Однако при любой среде рекомендуется посев минимум 2-3 материалов. Связано это с тем, что даже при нескольких пробах нет точной гарантии достоверности результата. Установлено, что при 6 посевах вероятность обнаружения туберкулёза увеличивается на 7-8%.

Заключение

Исследование мокроты при лечении туберкулёза – обязательное условие для контроля состояния пациента. Сбор слизи должен соответствовать всем требованиям, иначе будет портиться материал, появиться опасность заражения. Анализ можно проводить разными методами, каждый из которых имеет свои плюсы и минусы. При исследовании желательно сочетать сразу несколько технологий, чтобы повысить достоверность.